Ταυτοποίηση Gram θετικών αναερόβιων μικροβίων

Σοβαρές λοιμώξεις σε ποσοστό 50-60% είναι πολυμικροβιακές στις οποίες υπεύθυνα αίτια είναι αερόβια και αναερόβια βακτήρια. Οι περισσότερες αναερόβιες λοιμώξεις είναι ενδογενείς, λίγες είναι εξωγενείς, όπως λοιμώξεις από C. Tetani, C. Botulinum, C. Novyi και προκαλούν αντίστοιχα τέτανο, αλλαντίαση, και λοιμώξεις μαλακών μορίων ακόμα και τοξικό σόκ σε χρήστες ενδοφλέβιων ναρκωτικών ουσιών. Σε λοιμώξεις που παρουσιάζουν εκτεταμένη νέκρωση ιστών με παραγωγή αερίου, μετά σοβαρό τροχαίο ατύχημα ιδίως των κάτω άκρων (κλινική εικόνα αεριογόνου γάγγραινας) απομονώνεται ως αίτιο το C. Parfringens ή άλλα κλωστηρίδια. Οι νοσηλευόμενοι ασθενείς μετά τη λήξη αντιβιοτικών παρουσιάζουν ψευδομεμβρανώδη κολίτιδα η οποία είναι σοβαρό πρόβλημα και οφείλεται στο C.difficille. Τα βακτηρίδια του γένους Peptostreptococcus συμμετέχουν στο 25% των σοβαρών λοιμώξεων ιδίως όταν η εστία της λοίμωξης γειτνιάζει με βλεννογόνους οι οποίοι φέρουν αναερόβια χλωρίδα. Ο Actinomyces israeli προκαλεί την ακτινομυκητίαση και το P. Acnes επιμολύνει αιμοκαλλιέργειες, αλλά μπορεί να προκαλέσει λοιμώξεις (όπως εγκεφαλικά αποστήματα). Επομένως η απομόνωση των αερόβιων και αναερόβιων βακτηρίων καθώς και ταυτοποίηση τους από την εστία της λοίμωξης είναι απαραίτητη για τη σωστή αντιμετώπιση του ασθενούς. Η ταυτοποίηση αναερόβιων σε επίπεδο είδους βοηθάει στην περίπτωση επανειλημμένων απομονώσεων, αν η λοίμωξη είναι νέα ή υπότροπο, επίσης σε βακτηριαιμίες δίνονται χρήσιμες πληροφορίες για την πρωτογενή εστία και υπάρχει συσχέτιση ορισμένων αναερόβιων με νεοπλάσματα εντέρου. Στην παρούσα ανασκόπηση δένεται έμφαση στην προκαταρκτική ταυτοποίηση των κλινικά σημαντικών αναερόβιων βακτηρίων στηριζόμενοι σε απλές με μικρό κόστος ταυτοποιητικές δοκιμασίες.

Ταξινόμηση Gram θετικών αναερόβιων βακτηρίων

Ανάλογα με τη μορφολογία των μικροβιακών κυττάρων και την παραγωγή ή μη σπόρων διακρίνονται σε:

1.   gram θετικά σπορογόνα βακτηρίδια(περιλαμβάνεται το γένος Clostiridium spp με πολλά είδη)

2.   gram θετικοί αναερόβιοι κόκκοι. Περιλαμβάνεται το γένος Peptostreptococcous sp, από το οποίο έχουν αποχωριστεί με τη βοήθεια μοριακών τεχνικών τα γένη Micromonas sp, Finegoldia sp, Peptoniphillus spp, Anaerococcus spp.

Με τη νέα ονοματολογία στο γένος Peptostreptococcous sp περιλαμβάνεται μόνο το είδος Peptostreptococcous anaerobius, στο γένος Micromonas sp, περιλαμβάνεται το είδος Micromonas micros  στο είδος Finegoldia spp περιλαμβάνεται το είδος finegoldia  magna στο γένος Anaerococcus spp περιλαμβάνονται τα είδη: A. Hydrogenalis, A. Lactolyticus,  A, octavius, A. Prtevotti, A. Tetradius, A. Vaginalis.

Στο γένος Peptoniphillus spp περιλαμβάνονται τα είδη: Pn. Asaccharolytikus, Pn. Harei, Pn. Indolius, Pn. Ivorrii, Pn. Vaginalis.

1.   στα gram θετικά μη σπορογόνα βακτηρίδια

Ταυτοποίηση gram θετικών αναερόβιων βακτηρίων

Οι ακόλουθες κλινικές και εργαστηριακές πληροφορίες καθοδηγούν την ταυτοποίηση των αναερόβιων βακτηρίων:

Α. κλινικές πληροφορίες, οι οποίες είναι απαραίτητες και για την αξιολόγηση της καλλιέργειας και την ταυτοποίηση των βακτηρίων που απομονώνονται, αποτελούν:

1.            η δυσοσμία του δείγματος που οφείλεται σε ασταθή λιπαρά οξέα και στις αμίνες, οι οποίες παράγονται κατά το μεταβολισμό των αναερόβιων βακτηρίων, καθώς και η παραγωγή αερίου, είναι ενδείξεις αναερόβιας λοίμωξης.

2.            η θέση της λοίμωξης, όταν γειτνιάζει με βλεννογόνους οι οποίοι φέρουν αναερόβια χλωρίδα, τότε πιθανόν η λοίμωξη να οφείλεται σε αναερόβια βακτήρια.

3.            η προηγηθείσα χορήγηση αντιβιοτικών, μη δραστικών έναντι των αναερόβιων, όπως αμινογλυκοσίδες , κινολόνες, κοτριμαξόλης, χωρίς κλινική ανταπόκριση πιθανόν υποδηλώνει λοίμωξη με αναερόβια βακτήρια.

Β. μακροσκοπική εξέταση του δείγματος

Μαύρα αιματηρά ή πυώδη εξιδρώματα καθώς και πιθανός φθορισμός των εξιδρωμάτων μετά από έκθεση σε υπεριώδες φως, είναι ένδειξη αναερόβιας λοίμωξης.

Η παρουσία κοκκίων θείου στο δείγμα κάνει πιθανή τη διάγνωση ακτινομυκήτιασης.

Γ. άμεση μικροσκοπική εξέταση του δείγματος

Νωπό παρασκεύασμα: μικροσκόπηση σε σκοτεινό πεδίο ή  σε μικροσκόπιο αντιθέτου φάσεως για παρατήρηση των σπόρων και της κινητικότητας. Εξετάζεται η παρουσία σπόρων, το σχήμα και η θέση των σπόρων σε σχέση με το μικροβιακό κύτταρο, εάν δηλαδή είναι σφαιρικοί ή ωοειδείς, τελικοί ή υποτελικοι.

1.            Στο C. Difficille παρατηρούμε υποτελικούς ωοειδείς σπόρους ενώ στο C. Tetani  τελικούς σφαιρικούς. Τα περισσότερα κλωστηρίδια είναι κινητά εκτός από τα C. Perrfingens, C. Ramosum, C. Innocuum, που είναι ακίνητα. Βακτηρίδια του γένους Peptostreptococus είναι ακίνητα, όπως επίσης και τα gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα, με εξαίρεση κάποια είδη του γένους Lactobacillus.

2.            Άμεση χρώση gram  του μικροσκοπικού παρασκευάσματος: θέτει την αρχική υποψία της παρουσίας αναερόβιων βακτηρίων. Π. χ. σε άμεσο χρωματισμένο κατά gram παρασκεύασμα πυώδους υλικού η παρουσία gram+βακτηριδίων μεγάλου μεγέθους, χωρίς σπόρους, με τετραγωνισμένα άκρα, από ασθενή με κλινική εικόνα αεριογόνου γάγγραινας

Σε παρόμοιο παρασκεύασμα πυώδους υλικού από την τραχηλοπροσωπική περιοχή η παρουσία gram+βακτηρίων με διακλαδώσεις παραπέμπει σε ακτινομύκητα. Επίσης παρασκεύασμα πυώδους υλικού το οποίο κατά τη μικροσκόπηση παρουσιάζει gram+βακτηρίδια λεπτά χωρίς διακλαδώσει παραπέμπει σε λοίμωξη από άλλα μη σπορογόνα αναερόβια βακτηρίδια.

Για το αποτέλεσμα της χρώσης ενημερώνουμε την κλινική και έτσι  προσφέρουμε σημαντική βοήθεια στο καθορισμό της αρχικής εμπειρικής θεραπείας

Προκαταρκτική ταυτοποίηση αναερόβιων

            Συνήθως υπάρχει πολυμικροβιακή ανάπτυξη αναερόβιων και δυνητικά αναεροβίων βακτηρίων και είναι απαραίτητη η χρήση φακού ή ειδικού στερεοσκοπίου αποικιών για την παρατήρηση των αποικιών και τη σωστή απομόνωση των αναερόβιων.

Μετά τον εμβολιασμό του δείγματος στα κατάλληλα θρεπτικά υποστρώματα εμπλουτισμένα και εκλεκτικά και την επώαση σε αναερόβιες συνθήκες επί 48 ώρες τουλάχιστον εξετάζεται η μορφολογία κάθε διαφορετικού τύπου αποικίας από την οποία γίνεται χρώση gram και έλεγχος αεροβιώσεως με ανακαλλιέργεια της υπό εξέταση αποικίας σε αιματούχο και σο

σοκολατόχρωμο άγαρ, τα οποία επωάζονται αντίστοιχα σε αερόβιες συνθήκες και σε περιβάλλον διοξείδιο του άνθρακα επί 48 ώρες. Επίσης η ίδια αποικία ανακαλλιεργείται σε αιματούχο άγαρ με αιμίνη και βιταμίνη Κ, τοποθετείται δίσκος αντιβιοτικού στο τέλος της πρώτης αραίωσης, επώαση γίνεται σε αναερόβιες συνθήκες επί 48 ώρες για να έχουμε καθαρό καλλιέργημα του αναερόβιου βακτηρίου και να προχωρήσουμε στην ταυτοποίησή του.

Εάν δεν αναπτυχθεί το βακτήριο στο σοκολατόχρωμο άγαρ, ενώ έχουμε καλή ανάπτυξη στο αναερόβιο αιματούχο, τότε το βακτήριο αυτό είναι αναερόβιο. Φυσικά γίνεται σύγκριση των μορφοτύπων των αποικιών που αναπτύχθηκαν και στην αναερόβια επώαση. Δυσοσμία στο αιματούχο της αναερόβιας επώασης και περισσότεροι τύποι αποικιών από τις αποικίες στο σοκολατόχρωμο είναι ένδειξη αναερόβιας ανάπτυξης.

Όλα τα κλινικά μικροβιολογικά εργαστήρια θα πρέπει να απομονώνουν και να ταυτοποιούν τα  αναερόβια βακτήρια τουλάχιστον σε επίπεδο γένους και στη συνέχεια να αποστέλλουν τα στελέχη σε κέντρα αναφοράς αναερόβιων βακτηρίων για την τελική ταυτοποίηση.

Τελική ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους

1.           με βιοχημικές δοκιμασίες:εκτελούνται με προανηγμένα, αναερόβιος αποστειρωμένα υλικά

2.           συστήματα ταυτοποίησης που στηρίζονται σε βιοχημικές και ενζυματικές ιδιότητες των βακτηρίων

3.           με δίσκους ενζυματικών αντιδράσεων

4.           με την υγρή αέρια χρωματογραφία

Δοκιμασίες για γρήγορη ταυτοποίηση

Μορφολογία αποικιών: μεγάλες αποικίες με διπλή ζώνη β- αιμόλυσης  σχηματίζουν το C.perfingens και το C. Novyi.

Αποικίες που παρουσιάζουν ερπυσμό δίνουν το C. Sporogenes, C. Septicum, C. Tetani, C. Sordelli

Μεγάλες ριζοειδείς αποικίες με σχήμα πυραμίδας δίνουν πολλά κλωστηρίδια. Οι αποικίες του C. Difficille μπορεί να παρουσιάσουν πολυμορφία, δίνουν οσμή στάβλου αλόγων λόγω παραγωγής  κρεζόλης.

Χρώση gram εκτελείται από κάθε διαφορετικό τύπο αποικίας.

Μερικά κλωστηρίδια π.χ. C.tetani φαίνονται σαν gram αρνητικά. Η επιβεβαίωση της χρώσης θα γίνει με δίσκους ειδικής περιεκτικότητας.

Κλινικοεργαστηριακά χαρακτηριστικά αναεροβίων λοιμώξεων

Υπάρχουν φλεγμονές που προκαλλούνται αποκλειστικά από αναερόβια μικρόβια. Στις περισσότερες όμως ενδογενείς λοιμώξεις, ορισμένα κλινικοεργαστηριακά χαρακτηριστικά σηματοδοτούν τη συμμετοχή αναεροβίων. Από τα χαρακτηριστικά αυτά όπως περιγράφονται στον Πίνακα 1, μόνο η δυσοσμία της λοίμωξης θεωρείται ειδική. Ωστόσο, εν τω βάθει λοιμώξεις που προκαλούνται από μερικούς αναερόβιους κόκκους οι οποίοι δεν παράγουν πτητικά λιπαρά οξέα και αμίνες, δεν είναι δύσοσμες. Η παρουσία δύο ή περισσοτέρων χαρακτηριστικών είναι απαραίτητη για να τεθεί η υποψία της  αναερόβιας λοίμωξης.

Πίνακας 1. Κλινικοεργαστηριακά χαρακτηριστικά αναεροβίων λοιμώξεων .

·                     Δυσοσμία στο δείγμα

·                     Αέριο στο δείγμα

·                     Όταν η φλεγμονή γειτνιάζει με βλεννογόνο

·                     Όταν υπάρχει νέκρωση ιστών

·                     Λοίμωξη που οφείλεται σε δήγμα ανθρώπου ή ζώου

·                     Αρχική θεραπεία της λοίμωξης με αμινογλυκοσίδες

·                     Μαύρα – αιματηρά εξιδρώματα, πιθανόν φθορίζοντα ( Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella )

·                     Κοκκία Θείου    ( Actinomyces )

·                     Χαρακτηριστική μορφολογία στη Gram

·                     Αναερόβια ανάπτυξη

·                     Φθορισμός αποικιών